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肠道细菌的对家畜多糖降解(下篇)

时间:2013-06-27 来源:中国种猪信息网 作者:陈翠


肠道细菌的对家畜多糖降解(下篇)

能分解纤维素的,纤维降解肠道细菌的变化
    尽管在生黄瘤胃球菌中有清楚的证据表明纤维小体结构的存在,在相关的纤维降解菌白色瘤胃球菌菌株8中,至少有两种主要的纤维素酶不含有dockerins粘连模块。这些酶也可能通过其它机制锚定在细胞表面,它们还具有一段不一般的对碳水化合物有亲和力的羧基末端序列。尽管如此,dockerins对接模块已在其它的生黄瘤胃球菌菌株8的蛋白中以及其它生黄瘤胃球菌菌株中有所报道,因此酶复合体是否在该物种中存在是不确定的。白色瘤胃球菌另外一个有趣的特点是其细胞表面的菌毛被认为是与其细胞附着纤维素的过程起着重要作用。关于是否这样的菌毛也存在于生黄瘤胃球菌中或是相反地,是否类似于CttA的纤维素粘附蛋白液存在于白色瘤胃球菌中是有待于进一步研究的。
    除瘤胃球菌属以外,琥珀酸丝状杆菌也被认为是瘤胃中最重要的纤维降解菌,不论是从其数量上还是从其作用于难降解底物的活性上。纤维杆菌的品种分属于革兰氏阴性菌的不同门,同时也在草食动物的大肠中发现。产琥珀酸丝状杆菌的多糖降解酶具有复杂的多亚基结构,类似于具有纤维降解活性的革兰氏阳性厌氧厌氧菌的酶结构,但是从其基因组序列分析中并未发现dockerin  domains对接模块结构域或是scaffoldin   proteins脚手架蛋白。在该类群中,底物附着的起始步骤对其降解纤维素的能力起到决定性作用(框2)。最近鉴定多种不同的纤维素结合蛋白结合结晶的或不定型形式的纤维素。产琥珀酸丝状杆菌的这些特征表明表明其纤维素酶系统是非常独特的。不像其它的非纤维小体细菌以及目前所有发现的具有纤维小体结构的细菌,没有证明显示产琥珀酸丝状杆菌产48家族的外切葡聚糖酶,尽管该酶是其它类群中纤维降解的关键酶。此外,纤维素看起来精密地依赖于生长。对这个重要而有趣的纤维分解系统需要有更好的了解。
不溶性底物的黏附
    很多日粮多糖以不溶性微粒的方式进入肠道,最普遍的是植物细胞壁和淀粉微粒;一些宿主内源底物如粘蛋白也是不溶性的。附着底物的能力是降解过程最重要的第一步,而且是有效降解植物细胞壁多糖的先决条件。因而,纤维降解瘤胃细菌琥珀酸丝状杆菌和瘤胃球菌属的突变体因失去了底物附着能力而表现出纤维降解能力的退化或缺少。目前关于厌氧肠道细菌的主要群落的有关底物附着方面的分子机制和基因产物了解较少,但很有可能包括多种定位在酶或结构蛋白中的底物结合模块,就像糖蛋白中的碳水化合物部分。在革兰氏阳性厌氧菌中,如瘤胃球菌属,纤维小体相关蛋白,特定的附着蛋白和菌毛(见框1,表3和主要部分的细节。)最近针对革兰氏阴性纤维降解瘤胃菌属琥珀酸纤维杆菌的一项研究鉴定了13种膜外纤维小体结合蛋白,其中有几种在附着缺陷突变体中是缺失的。进一步的工作是从附着模块中辨别最初将细菌细胞锚定到多种底物的机制,其作用是增强个别催化区域的能力。还应该研究在黏附特定底物时相关基因表达序列的变化。
多形拟杆菌利用淀粉
    拟杆菌属是在瘤胃和人类大肠中所发现的厌氧菌群中数量最为丰富的革兰氏阴性菌群,已知能利用多种植物多糖。估测多形拟杆菌的基因组包含236个糖苷水解酶基因和15个多糖裂解酶基因。
    前期的工作表明多形拟杆菌的淀粉水解酶活性是与细胞紧密相连的,许多反应是在细胞周质中发生的。基于gene-disruption 基因打断的研究结果表明,淀粉利用基因簇(sus)是由8个基因构成,包括几个在淀粉利用方面起到基础作用的基因。推断最初将淀粉分子结合到多形拟杆菌的细胞表面的过程是通过一个含有麦芽糖诱导外膜蛋白SusC, SusD, Sus E 和SusF(图4)的复合体。SusC and SusD是紧密联系在一起的,并对淀粉结合起到重要作用;而对SusE and Susf的作用了解的相对较少。SusC被认为是一种在淀粉结合过程中起到重要作用的膜孔蛋白,并能吸收从麦芽糖(G2)大小到麦芽七糖(G7)大小的分子。SusG能编码一种膜外的新支链淀粉酶,该酶能断裂amylose, amylopectin and pullulan直链淀粉和支链淀粉的α - (1,4) linkages即α-(1,4)糖苷键,并推测该酶能将淀粉分子断裂为寡糖然后使其进入细胞质周质中。Gene-disruption基因打断研究表明susC ,  susD  and   susG对多形拟杆菌在淀粉培养基上生长是必需的。另一个由sus gene cluster基因簇所编码的新型淀粉酶SusA是存在于细胞周质中的,被推测为是在寡糖被转运进细胞膜之前负责将其水解的酶。缺少susA活性的菌株在淀粉培养基上的生长速率比野生型的慢30%。由susB基因所编码的α-葡萄糖苷酶存在于细胞周质中,多数该基因对细菌在淀粉培养基上的生长影响较小,推测起来大概是由于该菌所编码的α-葡萄糖苷酶种类较多的缘故。

4:多形拟杆菌针对可溶性淀粉的隔离系统
    SusC和SusD是将淀粉结合到细胞表面的基本的两个蛋白。SusG具有限制的水解酶活性,还有周质中更多的水解酶活性以及吸收寡糖通过细胞质膜。这幅图是基于Salyers及其合作者的论文。
因而sus基因簇对淀粉的利用起到非常基础的作用,尽管通过多形拟杆菌的基因组推测其至少编码7种淀粉酶和14种葡糖苷酶类。剩下的淀粉水解酶系统的其它组分所起的作用及其定位有待于进一步研究。正如最初所设想的那样,多形拟杆菌系统像是专门适应于捕获和截留可溶性的淀粉分子,并进一步在细胞周质内和细胞质内发生水解作用。在脆弱拟杆菌中的淀粉酶基因簇也包括susC and susD的同源物,但其调节方式不同于多形拟杆菌中sus基因的调节方式,但其受氧以及麦芽糖的诱导。
    多形拟杆菌的基因组能编码106个susC 的旁系同源物和57个susD的旁系同源物。其中的许多与可能利用多糖和寡糖的基因簇相连,这表明所推测的淀粉滞留模型可能也适用于其它类型的多糖。susC  and  susD的旁系同源物,与编码糖苷水解酶的的基因一起,与体外含葡萄糖的培养基中生长的相比,强烈地受在肠道内单一定植了多形拟杆菌并饲喂含丰富多糖日粮的无菌小鼠的正调控。多形拟杆菌的基因组也编码多个细胞质外功能型sigma因子以及双组份调节蛋白,包含了17个混合型调节因子(双组份混合在内),与susC/susD或糖苷水解酶基因相邻。其中的一个双组份调节蛋白被证明与多形拟杆菌在α-甘露糖苷存在的情况下诱导α-甘露糖苷酶的产生有关。
有生物化学方面的证据表明拟杆菌门的滞留机制能利用更多地可溶性多糖而非淀粉。在多形拟杆菌中,证明主要的周质定位是聚半乳糖醛酸利用酶,一种细胞膜外结合蛋白被认定为是粘蛋白衍生的多糖硫酸软骨素。多形拟杆菌在木聚糖培养基上生长较差,但在卵形拟杆菌以及瘤胃拟杆菌群的普雷沃氏菌中鉴定出部分与木聚糖利用相关的同源基因簇。卵形拟杆菌分解木聚糖基因簇的转录受混合的双组份调节因子控制,该因子受木寡糖调节。在木聚糖培养基上生长的细胞的大多数(90%)的诱导产生的木聚糖酶的活性要在细胞破碎后释放出来,这表明该酶大多数在细胞周质或细胞膜上存在。这表明能利用水溶性木聚糖但不能利用不溶性木聚糖的卵形拟杆菌有针对可溶性木聚糖分子的截留机制,尽管susC  and  susD的旁系同源物有待于进一步鉴定。
进化的思考
    尽管多糖利用的微生物系统呈现多样性,其基本构件却表现出很高的一致性。多糖降解酶中所发现的催化区域和结合区域因其初级序列和折叠的拓扑学结构可被归类于不同的家族。这些家族中的典型代表能在多种细菌和真核微生物中找到。GH11 xylanase一些第11家族的木聚糖酶结构域在来自瘤胃的原虫和真菌中发现,例如,与在瘤胃细菌中所发现的木聚糖酶第11家族的结构域的序列相似性很高。这表明水平基因转移对这些基因在属于不同的界的肠道微生物的基因的转移起到重要作用。推测起来,这对界之间的基因转移有更重要的作用。
    另一个关于多糖利用肠道细菌的显著特征是其拥有某个特定家族的多糖水解酶结构域和底物结合模块的多拷贝基因序列(CAZ y  database; see  further information)(表5)。从基因重复现象以及其在序列和功能上的分散可推断这导致了这种多样性的发生,从而产生了很多在底物专一性和动力学性质上有细微变化的多个变种。此外,基因融合以及结构域的移动也对进化起到一个重要作用,因为研究发现从许多细菌的群体中尤其是水解纤维素类的所发现的酶的多肽的高度复杂的模块结构是一致的。例如,在生黄瘤胃球菌中,在相同的多肽中可呈现4种不同的催化结构域,还有多个底物结合模块以及dockerin对接模块序列。先前融合的结构域和模块的复制紧随融合和重排过程,具有产生大批复杂酶结构的潜能。此外,水平基因转移使其他肠道群落的成员有获得这种复杂基因或基因簇的可能。

54 类肠道厌氧细菌针对来源于植物的多糖和寡糖的水解活性在所选的糖苷水解酶家族中的分布
    糖苷水解酶(GH)第5,9,44和48家族包含纤维素酶;糖苷水解酶第10和第11家族主要是木聚糖酶;糖苷水解酶第第26家族主要是甘露聚糖酶;而糖苷水解酶第13家族包括很多淀粉酶。GH2, GH3和GH43是多样性家族,各自主要包括β-半乳糖苷酶,β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶。在该图表中所提供的信息主要来源于Bifidobacterium longum、Bacteroides thetaiotaomicron VPI -5482,  Bacteroides fragilis  ATCC9343和非消化道纤维降解细菌Clostridium thermocellum  ATCC27405的全基因组序列, 正如CAZY数据库中所总结的那样(查看更多信息)。生黄瘤胃球菌菌株FD1的信息只涉及携带“dockerin”的多肽,并且基于基因组序列的草图(B.A.W., M.T.R.,  D. Antonopoulos 等,未公开发表的观察结果)。
     相反的是,在非纤维水解的拟杆菌中所发现的糖苷水解酶类主要是单亚基的多肽。这也可能反应出这一类群的基因产物的不同的细胞定位,以及其作用于小的、可溶性的碳水化合物底物这一事实。依据这一假设,这种复杂的多模块结构似乎是纤维水解菌群的胞外酶所特有的,它可能对不同的不溶性底物如植物细胞壁的胞外处理过程起主要作用。仍然需要像拟杆菌那样有大量的成簇的多糖酶基因,但是,不溶性底物的溶解产物仍然存在着大量的取代基和连接键。此外,就所能利用的可溶性底物的来源和范围来讲,这些细菌具有很大的变化性。
总结和结论
    我们对于肠道厌氧菌利用多糖底物的机制的了解非常地少。我们在此所列举的关于的一个关于革兰氏阳性细菌的能降解植物细胞壁的纤维小体系统和一个革兰氏阴性细菌降解可溶性多糖的滞留系统的二分支结构太过简单,因为在其广泛的变化中只有非常小的一部分是确定的。尽管推测纤维小体的结构既出现在降解纤维素的厌氧真菌中,也出现在革兰氏阳性细菌中,这也许是达到高效利用植物细胞壁的方法之一。例如非肠道梭菌属—粪堆梭菌不具有纤维小体结构,尽管其明显地有一个与产纤维小体梭菌Clostridium  thermocellum相似的小境。尽管在大量的革兰氏阴性拟杆菌中对其可溶性多糖的滞留机制研究的很多,但另一些在再人结肠中所报道的拟杆菌属细菌尤其是近期新发现的革兰氏拟杆菌属细菌Bacteroides cellulosilyticus,具有降解不溶性纤维素的能力。
    有关能降解某种特定多糖底物的肠道菌群的细菌的种系型的相关信息非常有限,例如在人的大肠中,能降解植物纤维的主要细菌大部分还未被鉴定,也许还未被培养,尽管这并不包括第四菌群瘤胃球菌的相近菌株。人类结肠的淀粉降解似乎与大多数已培养种类,尤其是拟杆菌属的菌株,低GC含量的革兰氏阳性菌如Ruminococcus bromii  and  Roseburia  spp布氏瘤胃球菌和罗氏菌属以及高GC含量的革兰氏阳性双歧杆菌。革兰氏阳性淀粉降解菌原生质间隙的缺乏表明其淀粉酶系统根本上不同于前面所描述的多形拟杆菌的,人的结肠中所发现的厚壁菌门的两个代表的大的胞外淀粉据报道酶直接锚定在细胞表面。关于双歧杆菌中的淀粉利用酶的功能的信息很少,尽管其基因组序列已知。有趣的是,在中性的发酵罐模拟系统下,拟杆菌貌似同其革兰氏阳性竞争者一同竞争可溶性淀粉,但是该种革兰氏阳性菌群在微酸性条件下竞争更具优势。
    给出多糖作为其在肠道的生长底物的重要性,了解其被利用的机制在预测其被特定的肠道细菌利用的小境以及微生物菌群对日粮组成变化的响应具有基础性的重要意义。这种了解需要更多地既包括培养分离物的也包括宏基因组分析的基因组信息(框3)。然而,要完善这些信息需要更大范围的肠道微生物的代表菌的功能分析。这些肠道微生物非凡的降解能力应用于各种生物技术领域具有很高的潜力。例如,分离的肠道细菌可用于木质纤维素底物的厌氧发酵来生产乙醇、琥珀酸、甲烷或氢气作为能源物质或化学原料。此外,编码纤维素分解酶系统的组件的基因为还未广泛研究的肠道微生物的改造提供了很多机会。这其中包括构建“纤维小体”或“微纤维小体”整合这种降解能力,研究单个基因产物的催化结构域和底物结合性质。在食品、动物饲料、造纸、纺织业、洗涤剂以及调控植物生长方面都能开发其应用。研究肠道微生物的各种多糖降解活性除了能加深我们对肠道微生物生态和代谢的理解之外能带来意想不到的收获。
从宏基因组获得的新信息
    到目前为止,所获得的关于多糖利用的酶系统的信息都是来源于对已培养细菌及其基因组。还有一种方法就是直接分析复杂的微生物群体的DNA,该技术被称为宏基因组技术。宏基因组技术最大的优点是不会遗漏难培养微生物。从鼠和人的后肠所获得的宏基因组DNA文库表明,通过测序发现其富含淀粉、蔗糖和半乳糖代谢的基因,这与已完成的拟杆菌的基因组测序是一致的。牛瘤胃DNA宏基因组的功能筛选也发现了新的糖苷水解酶和新的多酚氧化酶(漆酶)。宏基因组文库能引入新的碱基,然而,由于不能确保不同群体的微生物DNA插入是均等的,需要大量的克隆来代表整个宏基因组。然而,最近在大量的平行DNA测序方面的进展可能满足文库构建的需要。同直接克隆法一样,随机鸟枪测序法已被成功地应用于鼠的消化道微生物组。类似的研究还有关于三种不同的牛瘤胃纤维相关的微生物组的种系型组成和糖苷水解酶功能基因含量的比较,鉴于对难降解的主链(尤其是纤维素)的水解作用主要是由较不丰富的有机体完成的。这些研究表明焦磷酸测序和系统生物学的方法会成为研究定植于消化道的微生物群体的有力手段,以及肠道微生物在其自然栖居条件下的代谢能力。
 

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