摘要
    本文主要概述了公猪精液质量特性与母猪繁殖性能关联数据的处理方法。大型的母猪繁殖性能与公猪精液质量特性的现场生育数据库更适合用来分析影响精子质量的特点。母猪的繁殖性能有很强的多样性。影响精液的因素相对较小的，因此不可能在较小的数据库找到。大型数据库能够统计修正母猪和公猪的关联参数。处理后的母猪繁殖性能多样性数据可以与公猪精液质量参数进行关联分析，这对AI（人工授精）公司来说蕴含着巨大的利益。先前研究的由荷兰Varkens KI提供的（1）在一个授精剂量中精子细胞的数量（2）精子活性和形态缺陷（3）受精时精液被生产的时间长短等生产数据，以精子参数为依据，可以应用到公猪选择过程中，以提高人工授精质量。
    正文
    对于一个猪AI公司来说最重要的问题是精液质量特性如何可以与生育能力相关联。通过了解影响公猪精液生育能力多样性的因素，可以对影响因子的影响力以及今后精液出厂标准的价值进行评估。这一方法在一些文献中已有报道（Amann 1989；Gadea 2005；Foxcroft et al. 2008）。然而，一个好的有足够生育数据的生产数据库的分析工作十分复杂，目前还没有这样的工作完成。我们在本文中概述了以往的方法并且进行了讨论，希望可以找到新的方法，以显示公猪精液质量数据分析的意义，以及其在未来的AI行业中的应用价值。
    精液收集、处理和数据
    记录
    荷兰Varkens KI站的人工授精采用标准化的生产流程，整个生产过程在ISO 9001体系(ISO 9001 – 2008；Varkens KI荷兰、德文、荷兰)下进行。在AI站收集公猪精液有严格的程序，收集精液需佩戴手套（Hancock and Hovel 1959）。精液通过两步稀释法稀释。在收集后15分钟内，32℃条件下，精液用相同体积的短期Solusem®（≤72h）稀释扩大（步骤1）。第一步稀释后，将检测精子活性和精液浓度，以此对精液质量进行评估（新鲜、生产后24到72小时内），检测使用标准化Leja 4 -室计数板（Leja Products B.V.，Nieuw Vennep，The Netherlands）以及计算机辅助精液分析（CASA）系统Ulti-Mate^TM（旗舰版精子分析仪，Hamilton Thorne Inc.，Beverly，MA，美国）。每头猪第四次排出的精液将使用相差显微镜（固定、彩色样品）进行人工形态异常评估。精液质量评估后，在20℃条件下用Solusem®进行最后的稀释（步骤2）。稀释后的精液存储在17℃恒温房间内，可用于人工授精（每80毫升含有15亿有效精子数）。荷兰Varkens KI的AI数据库（KIS）记录了公猪采精相关信息，如公猪识别信息（纹身号码和名字）、家族遗传路线和年龄（当前的平均值：25±12个月）、采精的间隔天数（当前的平均值：4.5±2.5天）、精液生产的AI站地点和时间、精液收集者、处理精液实验室、评估精液质量的实验室技师、精液的体积和浓度（当前的标准：84*10⁹±11*10⁹细胞/一次射精）、活性（新鲜，生产后24到72小时）、形态异常情况、授精制剂的浓度和生产数量（当前的平均值：35±15）。每一次采精在AI数据库中都有一个特定的采号码。
    生产数据记录
    农民使用规定的授精剂量来为母猪人工授精，使用的授精剂的采精号码、返情日期，下一次授精使用的授精剂的号码、返情日期，产仔的日期和产仔数（总数、成活、死亡、木乃伊）都被记录。在荷兰农场每个生产周期授精次数为1.6-1.3。这一授精方案是在Steverink et al.的研究结果的基础上建立起来的（1997，1999）。每12小时进行一次发情检测，将待检测公猪放在母猪前面有利于母猪发情（Langendijk et al . 2005），当检测到没有发情则不进行授精。如果母猪在授精24小时后仍保持发情状态，则进行第二次授精。数据库中大多数的受精母猪是纯种的母猪，要么生产纯种后代或更频繁的生产杂种后代（F1生产）。在同一周期受精两次，且使用从两头公猪采集的精液的母猪，其生产数据在这一分析过程中被排除。在荷兰有两个可用的母猪管理系统（Pigmanager和农场），包含来自每个农民的标准化繁育结果。两个系统可以以电子版的形式交换育种数据。这些数据包括：（1）评估育种值（2）对农民在生殖管理（请求）方面的建议（因为其与生殖关联的结果也可以计算）。这些结果与采精信息合并建立起一个大型的用于分析数据库。
    数据库简介
    在荷兰，每年母猪生产427.5万次，其中98%的借助人工授精。荷兰Varkens KI每年大约生产18±0.037亿份用于授精的公猪精液。为成功实现人工授精，分析进行人工授精猪场的生育数据是至关重要的。猪遗传学协会（IPG，Beuningen，荷兰）的育种数据库(Pigbase)包含纯种和杂交母猪生育记录，这些数据被用于遗传评估和育种值评估。从这个数据集，两个授精的生殖参数被记录，即：（1）产仔率（FR），表明从最初受精母猪生产后代的比例，（2）产仔大小表明窝产仔数（TNB），这些参数用来与精液质量做关联分析。目前，荷兰Varkens KI的数据库包含超过100万份（1998 – 2010）生育数据，它将合并到Pigbase育种的数据库，后者包含来自750个农场的860万份产仔记录（< 2010）。通过合并，建起一个独特的用于分析精液质量和公猪生殖参数之间关系的数据库。
    统计方法
    每次采精可生产35±15（平均±SD）次的授精剂量，用于大约10-15头母猪受精。因此，每次射精最多10 - 15母猪记录是可用的。然而，事实上并不是所有的农场都交换信息，实际每次采精只有5 – 6头母猪的生产记录是可用的。生育结果也因个体和种群相关因素而呈现多样化，因此，首先需要计算母猪相关因素FR和TNB的最小均方差（LSM）对每次射精的生育记录结果进行修正。计算LSM是找到解决公猪一次射精生育结果多重性的一种统计学方法（SAS 9.1 Institute Inc.，Cary，NC，USA）。通过添加体重记录计算LSM用来处理校正因子。经相关因素校正因子矫正过的母猪生产数据是同等的，将排除如是否是同一遗传线路、农场和季节、一次或重复配种、产仔为纯种或杂种、断奶到发情间隔、每次发情的受精数量、使用年限、受精日期和授精时精子生产时间长短等因素。
    分析的下一步工作是提高参数的有效性和纠正公猪和精液中其他的影响生育能力结果的因素。为了分析精子活性和生育率之间关系，必须识别并分析以确定所有其他的公猪和精液的相关因素是否对生育结果有显著影响。重要的因素包括在最后的统计模型中同一遗传线与个别公猪的影响，公猪的年龄和采精间隔时间的差异，AI站和实验室技术员的差异，射精时的精子细胞的数量和稀释后精子细胞数量的差异。剩余的变量主要在于精液质量特征的差异。下一步分析确定这些特定的质量特性，如活性精子百分比，是否对生育能力产生显著影响，并且计算出这些影响的强度。对于一个AI公司，这些工作十分有益，因为使用此方法在体外测试精液质量可以检测牧场生育力，并且测试结果有助于从所有精液中有效地选择出好的精液。
    现场数据分析的利弊
    使用现场数据是有争议的，因为由于农场不正确的数据收集和记录它可能包含多种错误。育种领域数据库包含核心农场（纯种和杂交）的数据结果，那里的农民确实关注他们的数据记录，因此其结果的可靠性较高。有相关数据首先要检查其正确性，这是评估这些数据育种值必不可少的步骤。因此，用于分析的该生产数据库是兼顾数据的数量和质量独一无二的数据库。
    在一个来自多个农场的数据库中，影响生育结果的因素很多，找到精液与生育结果明显相关的因素是很困难的。为了能够校正这些因素，有必要对这个庞大的数据集进行统计学上的显著差异计算。然而，如果在这个分析中找到显著差异，这个分析结果将十分有说服力，因为这个实际偏差来自现场数据。
    为什么公猪精液质量的生产数据分析如此重要？
    大多数研究影响精子生育质量的工作在体外进行，并不在现场。表1显示了一些进行精液质量特征研究的示例，文献中没有体内生育结果的研究。例如，Smital（2009）对2712头公猪的230705次采精结果的精液的质量和数量进行了非常详细的研究评估。可惜的是，这次研究结果没有考虑与现场生育的关系。这个研究是有益的，但结果无法对现场工作提供帮助。文章中使用了不同于我们的测试方法、协议和系统，但作者没有描述与实际生产效果的关系。涉及到对生育能力影响的测试是比较有意义的，但不知道现场结果，我们无法建立处理精液的阳性判断标准。因此，只有在体外实验数据的基础上很难完成一个新的测试/参数。
    表1. 用于人工授精的公猪精液质量研究相关文献。结果中（A）代表没有现场生育结果数据，（B）代表小规模的基于现场生育结果的数据（< 100头/次公猪⁄射精），（B）代表带有大规模的基于现场生育结果数据（> 100头/次公猪⁄射精和⁄或> 1000次人工授精）。

作者	精子质量性状	种公猪数量	采精次数	人工授精次数
（A）
Boe-Hansen et al. 2005	DNA 完整性	20	60（每头猪3次）
Gill et al. 2009	形态, 活性	5	65（每头猪13次）
Paulenz et al. 2000	长期储存	16	16
Smital 2009	季节、公猪年龄、采精间隔	2712	230705（每头猪±85次）
Vyt et al. 2004	活性	30	900（每头猪30次）
（B）
Mircu et al. 2008	活性	10	270（每头猪±27次）	125
Popwell and Flowers 2004	活性、形态	3	120（每头猪40次）	664
Sutkeviciene et al. 2009	精核荧光性能	19	57（每头猪3次）	2296
Sutkeviciene et al. 2005	甲醇对活性的影响	36	288（每头猪8次）	13993
Tardif et al. 1999	活性	9	9（每头猪1次）	74
（C）
Anil et al. 2004	精子的寿命			35300
Boe-Hansen et al. 2008	DNA完整性	145	435（每头猪3次）	3276
Gadea et al. 2004	活性、形态、细胞膜完整性	57	273（每头猪±5次）	1818
Didion 2008	活性	208	3077（每头猪±15次）	6266
Holt et al. 1997	活性	53	170（每头猪±3次）	2200
Vyt et al. 2008	活性、形态	38	100（每头猪±3次）	276

 
    其他的研究人员的结果基于他们体内实验数据，但这些现场数据量通常很小。在他们的实验中，只有少数公猪（通常来自同一遗传线路）的精液样本，以农场环境的标准进行母猪管理和受精管理，确定发情或诱导发情和排卵后，在实验室条件下进行人工授精。如一个小样本（< 100）体内射精生育实验的例子，实验结构如表1B所示，该实验的优势是，体内实验实验组相对稳定，管理条件相同，精液质量参数的结果可以很容易地与实际的实验结果相联系，可能较容易得到一个重要关联的结论。然而，实际上体内实验数据差异必须相当大才能发现有意义的显著变量。一个重要的现实问题是这些实验结果是否可以推广到其他遗传路线的母猪、其他农场或其他不同遗传线的公猪。文献中公猪和精液的实验结果可能差异显著，但在整体公猪⁄精液正常生育范围内可能不显著，因此没有实践意义。使用的荷兰Varkens KI的现场数据库进行分析时结合了所有这些标准。因为FR和TNB的变化相当大，影响因素众多，用于寻找显著差异的生产结果数据数量相当可观。表1C显示使用超过100次采精和⁄或超过1000次人工授精数据的研究，这些采精与授精工作在更加的商业化实践条件下完成，分析中考虑到更多的参数变化。Gadea et al.（2004）得出结论，在商业条件下进行的精液分析导致检测的精液品质极差，但是通过提高细胞数量与质量可以降低可变性。Didion（2008）指出，尽管他使用了大型数据集（6266受精母猪），但与母猪交配公猪的数量太少，或每次人工授精使用的精液精子细胞数量太少，或每个发情期人工授精次数减少，会导致精液参数和生育率之间的关联性降低。我们现在建立的数据库包含大量的采精、公猪和与公猪交配的信息（100万采精和860万产仔数据），以指数倍数超过文献中的结果，这使得我们甚至可以以极显著水平发现最小的差异，这是这个数据库建立的最重要的价值。
    现场数据分析结果
    正如上面提到的，这个大型数据库的建立提供给我们寻找精液质量特性与生殖能力关系的机会。总的来说，得出结论：不同的育种路线和个体差异对猪的FR和TNB有显著影响（p < 0.05）（Feitsma 2009；Broekhuijse MLWJ，Sostaric E，Feitsma H，Gadella BM，未发表过的数据)。这个结论对AI公司处理来自不同育种路线的不同公猪很重要。先前的统计分析结果概括如下：
    分析了132345份有形态缺陷的采精数据后，对形态缺陷和生育能力之间的关系进行了分析。结果显示形态缺陷的数量和繁殖性状之间关系显著（p < 0.05）（Bergsma和Feitsma 2005）。将异常细胞的阈值从30%降低到20%，对生育能力产生积极影响：FR增加0.07%，TNB增加0.08%（Feitsma 2009）。根据分析结果，计算出了新截止值并在我们的AI公司的精液处理程序中实施。
    在受精时精子被生产的时长对生殖性状的影响的研究对AI公司生产实践同样有意。荷兰Varkens KI保证的受精制剂生产后72小时内的品质。然而在生产一线，农民使用的可能为生产后7天的授精制剂。由于这些结果也被记录，我们分析了精子年龄和生殖性状的关系。结果显示生产时间多达5天的精液对FR和TNB没有显著影响（p = 0.09）。这个结果可以用来重新分配AI公司的精液，平衡工作量避免在一周的开始时负载过高的工作。
    直到2006年，荷兰Varkens KI的实验室技术人员一直使用显微镜对精液活性进行评估。在1998-2006年期间，这些精子活性评估结果被记录，建立起一个> 110000份采精数据以及已知与之相关的生育结果的数据组。分析微观评估精液活性和生殖性状之间关系显示，虽然受AI实验室和技术员的影响较大，但两者差异不显著（p < 0.0001），（Broekhuijse et al.未发表数据）。
    为了具体化和规范化精液活性的评估，荷兰Varkens KI在2006年在所有AI实验室实施了CASA系统（UltiMateTM）。从最初3年的结果（2006 - 2009年，> 45 000份已知生育结果的采精信息），我们得出结论CASA活性参数与FR和TNB之间有显著联系（p < 0.05）（Broekhuijse et al.未发表数据）。此外，该方法得出的结果是客观的，因为没有了实验室技术员和AI中心对FR（p = 0.91），TNB（p = 0.40)的影响。
    在一个AI制剂中精子细胞的数量部分取决于活性精子细胞在排出精液中的比例。我们比较了两个时间段精子细胞数量对繁殖性状的影响。结果显示1998-2006年时间段AI制剂精子细胞的数量对TNB有显著影响（p = 0.01）。过去四年（2006-2010），AI制剂精子细胞的数量不再显示影响FR（p = 0.75），TNB（p = 0.52）。这个结论在2010年一个系统统计分析中得到证实。
    虽然不是经常生产，但冻存精液在猪人工授精工业中有特定的需求，尤其是国际性的育种公司核心群的遗传路线追踪。原则上，存活的解冻精子和受精结果可以以本文所提到的与新鲜稀释精液相同的方式进行评估。此外，新鲜稀释精子的特点似乎与他们解冻后属性一定程度上相互关联（Feitsma等，未发表结果）。正如前面提到的，冷冻公猪精液目前只有一小部分AI市场。因此，实际上用于人工授精的冷冻精液的数量太少而无法得到低温保存与生殖性状之间的可靠关联。大型数据库原则上可以在未来得出这种关联性，其结果可以用来选择适合低温保存精液的公猪。
    实践中的监测结果
    从商业的角度来看，对AI公司来说，在实践中监督生产的结果非常重要。了解生产现场中精液的性能并且保持跟踪记录，能够有效的分析出个别农场业绩差的原因。确定AI公司的工作标准：一个授精剂量中适当数量的活性细胞、允许形态缺陷细胞比例最大值、CASA活性参数最优值和受精剂量的保质期，可以使AI公司尽可能的高效运转，并且在尽可能低的成本价格获得最大价值的生殖能力。有一个例子是减少一个授精剂量细胞的数量。降低一个授精剂量的细胞数量会带来预知的生殖率降低的风险，荷兰Varkens KI知道这个效应，我们能够为AI公司和我们的客户计算出更低的下限。对这些参数的持续统计分析保证了新的决策点的执行效果。
    最后，该现场生产数据库将被用于分析其他的用流式细胞仪记录的新的精液质量特征（如膜的完整性、顶体完整性、顶体反应、染色质结构和线粒体膜）与生殖性状的联系。通过这种方式，我们可以评估这些流式细胞仪检测项目与繁殖性状的实际相关性(未发表过的数据)。最终目标是结合体外测试相关结果去得到一个精子质量指数，来决定应该采多少次精，每授精剂量应该使用多少精子细胞，保质期是多久以及预期的生育率。另一方面，这个指数可以用来确定正常种猪临界值。使用这样的一个系统可以使AI公司在产品质量和管理效率方面取得巨大的进步。
    结论
    为了监控生产结果和分析精液质量特征和生育之间的关系，收集生产数据并且将之与采精记录融合可得到一个非常强大的工具。它所得到的价值远高于收集数据付出的努力。使用生产数据优于实验数据表现在所有影响生育能力的因素可以量化和修正，这使得生育性能的变化可与精液的因素联系在一起。这些变量可以通过精液质量特征（如形态异常细胞、年龄的精液、精液活性和每授精剂量精子细胞的数量）来分析。在实验设置和⁄或条件下的实验数据可以显示出一个具体的精液质量参数的影响。然而，无法应用到其他遗传线路、农场、公猪和采精工作，从小型实验得到的结果不实用。猪AI中心对加工过程和授精制剂生产的控制策略的改变，应基于精子质量与生殖能力实际生产关系的分析数据。