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分子育种技术在中国地方猪种选育中的应用

时间:2013-07-01 来源:《上海畜牧兽医通讯》 作者:佚名


   摘要:正在动物基因组测序计划的推动下,猪的育种技术已从常规育种方法过渡到以分子标记辅助选择(Marker-assistedse-lection,MAS)技术主导的现代分子选育,朝着快速改变基因型的方向发展。我国地方猪种因蕴藏丰富有益功能基因,日益成为培育优良猪种后代、提高优良性状选择效率的研究重点。1分子育种研究的内容和特点传统育种主要利用表型来推断基因型
关键词: 基因型; 中国地方猪种; 受体基因 ;主效基因 ;候选基因 ;优良性状; 相关基因; 肌内脂肪 ;基因多态性; 繁殖性状
在动物基因组测序计划的推动下,猪的育种技术已从常规育种方法过渡到以分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)技术主导的现代分子选育,朝着快速改变基因型的方向发展。我国地方猪种因蕴藏丰富有益功能基因,日益成为培育优庭猪种后代、提高优良性状选择效率的研究重点。
分子育种研究的内容和特点
    传统育种主要利用表型来推断基因型、估计育种值,时间长、成本高,不能选择基因型纯合的个体。分子标记技术利用RFLP、RAPD、AFLP、EST、SSR、SCAR以及STS、mtD-NA等标记形式,对不同发育时期的个体、器官甚至细胞作检测,直接反映DNA的序列差异,标记位点丰富,遍及整个基因组,多态性高,遗传稳定,不受环境及基因表达与否的限制。分子选育通过寻找影响数量性状的主效基因或紧密连锁的基因标记,定向筛选满足特定需求的基因型,弥补了传统选育准确率低的缺点,大大提高选择的准确性。
    国外对分子标记基因的研究非常活跃,已在猪19条染色体中发现了丰富的DNA多态性,猪的连锁图谱已有超过5000个标记、放射杂交图谱定位了4000余个标记基因。借助基因图谱和QTL扫描,鉴别出了许多影响经济性状的QTL。2006年猪数据库从93种出版物收集了236个不同性状的1263个基因,2007年有110种出版物确定了1675个基因位点。到2010年4月,猪的QTL数据库PigQTLdb中已记载了5732个QTL座位,涉及日增重、背膘厚度和瘦肉率等558种性状。研究结果显示,分子育种与常规育种相结合,可大幅提高育种效率和进度;加快培育优质、高产、抗病、高效的瘦肉型猪,成为现代遗传育种的研究重点。
我国地方猪种进行分子选育的必要性
    我国猪种资源丰富,收入联合国粮农组织物种多样性系统的中国猪品种数目为150个,约占世界总数的三分之一。据2004年11月出版的《中国畜禽遗传资源状况》统计,认定的地方猪种有72个,其中34个为国家级畜禽遗传资源保护品种。地方猪种在生长、胴体和肉质等方面具有不同的种质特性和性状差异,大多数品种繁殖力强、肉质鲜美、抗逆性强、肉质参数明显优于国外品种。世界很多著名猪种都有我国地方猪的血统,如公元27~395年古罗马通过引进中国华南猪改良当地猪而育成罗马猪;18世纪(明代)英国通过引进广东猪改良本地猪而育成约克夏和巴克夏;现代美国、法国、英国、日本等国都引进中国猪种,从而培育出了产仔率高和肉质好的优良猪种。
    中国地方猪种蕴藏着丰富的优秀基因,不含氟烷敏感基因阴性纯合子或频率极低,天然抗病性、抗应激特点与繁殖性能、肉品品质相关基因最受国际关注,也最具民族特色和国际竞争力,是我国养猪业持续发展的坚实基础和潜在优势。
    我国科学家在上世纪90年代初开始猪的基因组研究,用于探索、利用我国地方猪种遗传资源。吴常信、李宁等(1994)不仅证实了Rothschild等人的研究结果,同时还发现促卵泡素β亚基基因是控制猪产仔数的另-主效基因;1999年利用我国二花脸太湖猪与外国商业猪种约克夏杂交,构建了亚洲最大的资源群,证明了雌激素受体(ESR)基因是一种广泛存在的、控制猪产仔数的主效基因;创造性地建立了多种检测猪高温应激综合征的诊断技术;华中农业大学、华南农业大学等发现MC4R基因对猪的生长和瘦肉率性状有显著影响。随着DNA芯片技术的应用,极大地促进了DNA标记辅助技术的实用化。
    我国地方猪种研究成果的获得,不仅引起了国际同行的关注,更有效推动了国内家猪的分子选育。从注重提高生长速度、增加胴体瘦肉率等生长和胴体性状选育到关注肉质性状选育,研究范围不断扩大,特别是对产仔数和早期生长基因研究有了突破性进展。通过对重要性状的基因或主效基网进行克隆、测序与定位及功能鉴定,利用不同品种资源的优势互补,已培育出多个中国特色地方猪种的专门化品系和配套系。近年利用能表达的融合基因、嵌合体、不同动物蛋白基因的DNA互补等技术,通过基因转移进行生长率、增重等重要生产性状改良实践,开展非常规性育种性状(如生产人类药用蛋白)和遗传抗性育种研究。
中国地方猪分子育种研究进展
    通过定位数量性状位点(QTL),分析候选基因与生产性状的关联,评估候选基因间的互作和-因多效作用,一些遗传力较低(如繁殖性状)、费用昂贵(如抗病性)、表型值在发育前早期难以测定(如瘦肉率)或限性表现(如产奶量)的候选基因,陆续被发掘、确认(见表1略),并开始应用于育种实践,有效提高了我国地方猪种在生长发育、胴体、肉质、繁殖和抗病、毛色相关育种的选择效率。
    通过表1略可以看出,我国对影响猪的经济性状基因研究主要集中在生长、繁殖性状提高与肉质性状改良方面,抗病性基因研究较少,可能与控制抗病性遗传受体基因的寻找和确定困难、疫苗研究费用高及药物治疗实验周期长有关。
3.1 功能基因多态性与生产性状关联研究
3.1.1 生长发育及胴体性状相关基因
    中国地方猪生长发育相关的候选基因研究主要涉及初生重、生长速度以及日增重等,包括FUTl、GHRH、GHR、POUlFl、Mef2、TG、POMC、IGF、MYOG、CETP、GH、MSTN、CCK和Leptin等功能基因。
    宋成义等(2001)研究了GH基因部分突变位点对生产性能的影响,发现姜曲海猪GH基因ApaI酶切突变位点G4G4基因型个体0~70日龄日增重与70日龄体重极显著高于G3G3/G3G4基因型个体(P<0.01)。柳淑芳等(2002)证明FSHβ基因座位在莱芜猪种中与控制猪产仔数的主效基因紧密连锁,优势基因AA纯合子比BB纯合子母猪平均每胎多产仔l.2头。杨仕柳等(2004)对129头湘黄猪Atrn基因进行检测分析,发现BB基因型猪的平均日增重、背膘厚和估测瘦肉率明显优于AB基因型猪。孔路军等(2005)实验发现,瘦肉型猪血清中Ob基因含量显著高于脂肪型猪,Ob基因mRNA表达丰度和kptin浓度呈高度正相关,两者与初产母猪血清FSH、LH和总产仔数成正相关,与初生个体重呈负相关。刘剑锋等(2005)发现中畜黑猪I系H-FABP基因座HH和hh2种基因型间个体170日龄体重差异显著。姚国佳等(2006)对仔猪皮下脂肪Leptin的表达量进行了分析,发现l~56日龄的仔猪leptin表达量呈现先高后低的趋势。赵晓枫等(2007)对金华猪IGF15’调控序列微卫星座位研究发现274bp和286bp等位基因有利于提高初生重,280bp的等位基因有利于第二胎出生窝重的提高。鲁绍雄等(2007)以MYOG基因作为撒坝猪生长性状的候选基因,研究发现4月龄体重和45日龄至6月龄日增重有显著影响,以AB型最高,AA型最低。鞠慧萍(2007)研究苏太猪FuTl基因,发现AG型个体平均繁殖性能均高于GG型个体,且AG型个体的1胎断奶窝重、2胎断奶窝重、3胎总产仔数和6胎断奶窝重显著高于GG型个体。魏麟等(2007)证实湖南黔邵花猪CETP各基因型对生长性状的影响差异显著,对膘厚的影响差异极显著,Aa基因型对初生重、45日龄重、6月龄重、体高、体长等性状的影响较大,AA基因型较小。金甲正等(201l)研究GH基因多态性对三江白猪仔猪初生重的影响,证实AB基因型的仔猪初生重显著高于AA、BB基因型的仔猪,而AA基因型和BB基因型的仔猪之间差异不显著(P>0.05)。
3.1.2 繁殖性状相关基因
    中国地方猪繁殖性状候选基因的研究,尤其是与猪产仔数性状相关的候选基因研究取得了较大进展,发现大多数基因与猪下丘脑-垂体-卵巢轴分泌的激素及其受体、激活素、抑制素以及早期胚胎发育有关。主要有ESR、FSHβ、OPN、PRLR、RBF4、RARG、NCOAl、MTNRlA、GnRH、GnRHR、LH、LHR、FSHR等基因。
    从1993年开始,我国科学家研究发现了我国特有地方品种二花脸太湖猪(世界上产仔数最高的品种)存在着产仔数主效基因,并精细确定了FSHβ基因是控制猪产仔数的主效基因,FSHβ基因BB型母猪较AA型母猪总产仔数平均每胎可多产出1.5~2.0头,而活产仔数平均每胎则多产出1.0~l.5头。杜立新等(2002)对中国优良地方猪种莱芜猪等FSHβ序列分析证明,FSHβ基因座位存莱芜猪种中与控制猪产仔数的主效基因紧密连锁,优势基因AA纯合子比BB纯合子母猪平均每胎多产仔1.2头。欧阳克蕙等(2004)采用开放式群体继代选育法和分子生物技术结合选育大约克夏母系,在其核心群内淘汰了氟烷敏感基因,头胎产仔数增加0.88头,产活仔数增加0.80头,公母猪达100kg体重时日龄分别缩短17.14d和14.62d。李永辉(2005)对NCOAl基因与猪产仔性状的相关及序列分析,发现NCOA1基因对产仔性状有显著影响,A等位基因为优势有利基因。刘卫东等(2006)证实FSHβ基因B等位基因和ESR基因A等位基因具有增加总产仔数和产活仔数的效应,其加性效应分别为1.515和1.325。刘蝉娟(2007)对莱芜黑猪等猪种进行ESR和FSHβ基因多态性分析,发现ESR基因在引进猪种中以AA型出现频率高,地方猪种以BB型频率高;FSHβ基因在引进猪种的基因型中以BB型出现频率高,地方猪种AA型出现频率高。张浩等(2007)对藏猪ESR、FSHβ和PRLR3个繁殖性状主效基因位点的基因型多态性研究表明,优势基因型分别为BB型、AB型和AA型。管峰等(2007)分析猪Prepro-orexin基因第62位多态性位点在二花脸、香猪、淮猪和姜曲海猪4个品种中的多样性与不同基因型对二花脸猪产仔数的影响,发现各等位基因频率和基因型频率在不同品种间存在显著差异。张冰等(2007)对陆川猪leptin基因进行单核苷酸多态性(SNPs)检测,发现了2个SNPs位点在第3469碱基处发生T→C突变和3714碱基处发生T→G突变,其中T3714GSNP对陆川猪产仔数影响显著(P<0.05)。刘轩等(2010)通过分析76头藏猪单基因和多基因合并对繁殖性状的影响,发现FSHβ、ESR和PRLR基因不同基因型繁殖性状差异显著,多基因聚合效应高于单基因效应。王国栋(2010)利用微阵列技术筛选大白猪和二花脸猪经产母猪排卵差异表达基因,发现Ear
I多态位点与所有胎次的总产仔数(TNB)、产活仔数(NBA)显著相关,基因加性效应差异显著。
3.1.3 肉品质性状相关基因
    肉质品质好是我国地方猪种突出的优良特性之一,也是我国地方猪分子育种选择的一个重点。与肉质品质相关的基因主要有:CAST、HSL、LPL、CAPN、FABP、MYOD、Hal、RN、MC4R、DGATl等基因。
    方美英等(1999)发现我国地方品种猪不含Hal与RN基因或频率极低,地方猪种除枫泾猪带有0.100氟烷基因频率外,在其他猪种均未发现。吴桢方(1998)研究发现HSL和LPL基因可以作为猪背膘厚选择的分子标记。孙博兴等(2000)将常规选择指数法与应激敏感基因型选择法相结合,应用于军牧l号白猪四、五世代核心群的选种中,使应激敏感基因频率下降了12%。雷明刚等。(2001)分析了猪HSL基因外显子1区多态性,发现不同品种猪间存在多态性,通城猪和清平猪AA和AG两种基因型等位基因A、G的频率分别是9l.67%、8.33%和89.83%、10.7%。刘桂兰等(2002)采用PCR、RFLP技术发现MC4R基因型频率在不同品种群体中的分布不同,MC4R基因与猪胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、平均背膘、眼肌宽度、眼肌面积、皮率呈显著性相关。刘桂兰等(2003)分析了影响猪瘦肉量的IGF2基因第8内含子部分片段酶切位点,发现B位点酶切未突变个体均比酶切突变的个体背膘薄18.28%,肥肉率低22.43%,瘦肉率高8.71%;A位点具有相同的影响趋势。姜勋平等(2005)用PCR-RFLP方法检测139头杂交猪FUTl基因型间肉质和胴体性状差异,发现AA基因型猪3个部位肌肉pH值均比AG基因型的高,肌肉系水力、肉色值、瘦肉率显著高于AG猪(P<0.05),表明FUTl基因的AA基因型对肉质和胴体性状具有显著的正遗传效应。朱砺等(2005)分析Myf-6基因在12个中、外猪种及部分杂交群体中的分布情况,发现Myf-6基因具有增加胴体瘦肉率和眼肌面积,降低胴体脂肪含量,改善胴体品质的遗传效应。肖石军等(2006)对影响猪生长肥育性状的MC4R主效基因的研究表明:MC4R基因G等位基因在中国地方猪种中呈高频分布,GG基因型个体的胸、腰、臀部膘厚较AA基因型和AG基因型个体厚,GG基因型个体的240日龄重、至240日龄平均日增重大于AA基因型个体.GG基因型个体的腹脂率高于AA基因型个体,差异显著。李长龙等(2006)对梅山猪、苏太猪研究表明,H-FABP、MCAR、ADDl三个基因的多态性分布在不同猪种间存在极显著差异,这种差异可能是肌内脂肪(IMF)或背膘(BF)不同的主要原因之一。耿忠诚(2006)研究了三江白猪H-FABP基因的5’上游区和第2内含子区的遗传变异,表明H-FABP基因的单倍体AAdd
bbHH基因型具有最高的IMF含量。程丰等(2006)利用PCR-RFLP技术对新荣昌I系猪的CAST基因进行多态性分析,并就限制胜酶切位点多态性与新荣昌I系猪肉的嫩度、肉色、滴水损失、失水率、大理石纹和肌内脂肪含量等肉质性状的相关性进行了分析,首次发现CAST/MSpI酶切位点DD基因型与肌脂含量IMP存在显著正相关;CAST-RsaI酶切位点EF基因型与失水率LAIR存在显著负相关。王刚等(2007)对莱芜猪和鲁莱黑猪的研究发现,LPL基因是肌内脂肪沉积的重要参与者。曲亮等(2008)分析HFABP和HSL基因多态性对苏淮猪胴体性状的影响,证实H-FABP、HSL基因可以作为胴体性状的候选基因用于猪的辅助选育。
3.1.4 抗病性相关基因
    猪群对大多数疾病的抗性受微效多基因与环境共同影响。提高饲养管理水平和应用药物疫苗可有效控制疾病,而利用抗病育种从遗传上提高畜禽对病原的抗性、加强免疫功能,对控制和消灭传染病更具治本功效。
    受抗病育种潜在经济效益以及制作人类疾病动物模型诱人前景的影响,寻找与免疫相关的控制综合抗病力候选基因,培育整体免疫力高的品种正成为研究热点。有关猪抗性基因的研究主要集中在于扰素基因、干扰素受体基因、NRAMP基因、FUT基因、抗流感病毒基因、MHC等位基因、猪大肠杆菌K88和F18受体基因等方面,包括SLA、BPI、NRAMPl、INF、Mxl、RYRl、ETEC等基因。
    国内近年开始将抗病育种技术研究应用于多种畜禽疾病防治,并在生产实际中成功克服了猪的应激综合征。晏学明等(2004)研究表明,杜洛克、长白、大白、汉普夏和皮特兰5个猪种在FUTl基因座位存在多态性,抗性基因型AA分布频率为0.028,长白猪与大白猪基因型频率差异极显著,与皮特兰猪之间差异显著。刘鑫等(2006)试验表明,猪13号染色体上与F4受体紧密连锁的微卫星SW458座位AC基因型,在沙子岭、大白两个猪种中无黏附表型,有望作为ETECF4抗性选育的遗传标记。袁树楷(2007)在荣昌猪BPI基因外显子3区段检测到一个新的SNP位点,认为该位点的突变对荣昌猪BPI蛋白功能及机体天然免疫力有重要影响,可能成为猪机体抗某些革兰氏阴性病原菌或其引起的疾病的分子标记。张澈君等(2009)采用高通量的基因芯片新技术筛选猪抗病基因标记及其应用的研究,发现SNP基因位点与猪呼吸与繁殖综合征(猪蓝耳病,PRRS)临床症状显著相关,并筛选出7个与猪蓝耳病(PRRS)临床症状相关的SNP位点标记,RYR位点可用于判断抗应激性能;FUTl基因位点可用于判断大肠杆菌性能;P2-EHMT2可用于判断抗体高低的标记。朱弘焱等(2010)证实Mxl基因频率存存差别,荷包猪群体免疫水平高于大白猪,且携带更多Mxl抗病性基因。邢凤(2011)利用基因芯片技术对猪感染PRRSV后肺脏组织基因表达谱差异进行研究,证实不同猪种对PRRSV反应不同,在被PRRSV感染后,肺组织中表达的基因具有较大差异。
3.2 基因的克隆与功能分析
    随着中国地方猪种基础研究的深入,一些影响地方猪种优良性状的重要功能基因陆续被发掘,并开始应用于分子遗传特性、功能和表达的研究与生产。
    1989年中国农业大学开始将猪生长激素基因转入湖北猪受精卵中,1990年首批转生长激素基因猪在湖北省农科院诞生,经过几个世代的观察,其生长速度和饲料利用率分别比同窝非转基因猪提高13.4%和10%。陈福祥等(2004)克隆了广西巴马猪、贵州香猪及云南小耳猪DQA基因的cDNA,测序发现了3个猪DQA新的等位基因。杨秀芹等(2005)获得了东北民猪MSTN基因编码序列,并进行了核苷酸测序研究。高凤山等(2006)以巴马小型猪为研究对象,从脾脏克隆,其SLA-2等位基因,氨基酸同源性分析显示与其它SLA-2、SLA-3和SLA-l序列的同源率分别为88.4%~96.4%、88.3%~90.5%和87.7%~92.7%。刘源(2006)对猪DGATl和Ob基因进行SNP扫描和多态性分析,对莱芜猪DGAT1外显子6至外显子8共476bp的序列进行了克隆、测序,发现一个影响萊芜猪群体初生重位点基因。赵献芝(2007)定位微卫星标记SW2116与猪多趾基因存在连锁关系,并对猪多趾候选基因Lmbrl基因进行了克隆。林莉等(2007)对中国4个小型猪五指山猪、贵州香猪、滇南小耳猪和藏猪的GH基因进行了克隆测序,发现4个品种小型猪和长白猪、雅南猪、内江猪的核苷酸序列共有63处发生变异,变异率为2.9%。袁树楷(2007)首次克隆得到了荣昌猪BPI基因全长cDNA序列,并在荣昌猪BPI基因外显子3区段检测到一个新的SNP位点,发现第397位的G→A突变可能对荣昌猪BPI蛋白功能及机体天然免疫力有重要影响。何小平(2008)分离克隆了LPINl、LPIN2和LPIN3三个基因,通过克隆、染色体定位、组织表达谱分析、多态位点检测及与胴体和肉质性状的关联分析,发现LPINl基因编码区的TaqI多态位点与眼肌面积、板油率和肌内脂肪含量存在显著相关。
    孙金海等(2010)通过利用转诱导型生长激素开展相关基因猪培育,获得15头体内被转入绿色荧光蛋白基因(EGFP)和猪生长激素基因(pGH)转基因猪。赖良学等(2011)利用2A短肽序列,通过一次克隆即成功培育出8头能够同时表达4种荧光蛋白的转基因克隆猪,实现了多基因在高水平上的协同表达,标志我国转基因克隆猪技术达到国际领先水平。这为加速我国地方猪的遗传性状转基因改良,促进含多种优良性状的转基因克隆猪的研究与产业化,以及为制作人类疾病动物模型与器官移植供体奠定了基础。
结语
    尽管分子育种尚处于与常规育种结合应用的探索阶段,影响猪QTL数量性状的大量新基因、新标记仍有待发现,有关QTL和主效基因仍需在实践中进一步验证,但标记辅助选择、标记辅助渗入以及基因转移或敲除技术的发展,已突显分子育种在快速改良地方猪种的优势作用,合理利用地方猪种间的差异和杂种优势,选育在生活力、生长势、繁殖力、适应性以及产量、品质、抗病力等方面超过双亲的后代,必将成为猪种培育和改良的重要手段和目标,并在保护和利用地方猪资源中发挥重要作用。